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RNA m6A甲基化測序MeRIP-seq

N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉(zhuǎn)錄組修飾之一，在幾乎所有生命的細(xì)胞RNA中都有發(fā)現(xiàn)，普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區(qū)域中。

0755-28507994

產(chǎn)品介紹

N6 -甲基腺嘌呤(N6-Methyladenosine, m6A)是非常豐富的轉(zhuǎn)錄組修飾之一，在幾乎所有生命的細(xì)胞RNA中都有發(fā)現(xiàn)，普遍分布在mRNA和lncRNA在3’UTR區(qū)域中。m6A功能非常豐富，包括調(diào)節(jié)RNA的剪接、核輸出、穩(wěn)定性和翻譯來影響RNA的命運和表達，也因此成為近年來國內(nèi)外的研究熱點，國自然的研究數(shù)目屢屢攀高。為了滿足廣大科研工作者的需求，艾斯基因推出微量以及常量m6A甲基化免疫沉淀測序（m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing，m6A MeRIP-seq），在全基因組范圍內(nèi)鑒定具有m6A修飾的區(qū)域。其原理為通過特異識別m6A修飾的抗體，對細(xì)胞內(nèi)具有m6A修飾的RNA?段進?免疫共沉淀。對沉淀下來的RNA?段進??通量測序，結(jié)合?物信息學(xué)分析，對樣本m6A修飾進?系統(tǒng)研究。MeRIP-seq是?前研究m6A修飾使?較普遍的技術(shù)之?。

重要技術(shù)質(zhì)控，用心服務(wù)每一個項目

艾斯團隊專注表觀組學(xué)12年，提供表觀多組學(xué)完整解決方案；

每年服務(wù)100+海外和國內(nèi)企業(yè)及200+高校和醫(yī)院等客戶;

已經(jīng)完成人、動植物等幾十個物種, 5000+例樣本項目;

嚴(yán)格m6A MeRIP建庫質(zhì)控和效率;

自動化樣本處理、建庫及分析流程，保障高效周期，40天極速交付;

團隊已經(jīng)發(fā)表Genome Biol、Nat Commun、Cell Res等高水平SCI文章；

專業(yè)的生物信息分析團隊, 提供更多個性化分析思路和方案

樣品類型和要求

樣本類型	樣本要求
Total RNA	提供去蛋白并進行DNase處理后的完整Total RNA，樣本總量不小于20 ug，樣品濃度不低于100 ng/uL。
培養(yǎng)細(xì)胞	提供不少于1x10*7個細(xì)胞，收集貼壁或者懸浮細(xì)胞、用PBS（RNase-free）洗滌1次，加入1mL Trizol反復(fù)吹打細(xì)胞至看不見成團的細(xì)胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；液氮速凍，-80℃保存，干冰運輸。
新鮮動物組織	提供切成1cm2左右的組織塊，不少于2g；將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好，迅速置于液氮中速凍，-80℃保存，干冰運輸；皮膚、骨、結(jié)締組織、脂肪等特殊組織建議送備份
新鮮植物組織	提供切成1cm2左右的組織塊，不少于5g；將組織塊放入旋蓋凍存管中密封好，迅速置于液氮中速凍，-80℃保存，干冰運輸
其他類型樣本	咨詢技術(shù)支持
備注：用封口膜密封樣品; 干冰運輸；送樣前備注好物種、部位、保存時間

數(shù)據(jù)信息分析

DRS	分析內(nèi)容	備注
標(biāo)準(zhǔn)分析	1、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估	過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量
	2、參考序列比對分析	比對率和覆蓋度分析
	3、m6A Peak Calling	鑒定具有m6A修飾的區(qū)域
	4、m6A Peak motif	m6A修飾區(qū)域的序列偏好性
	5、m6A Peak圖譜分布	m6A修飾在轉(zhuǎn)錄組上的分布
	6、差異m6A Peak分析	分析不同樣本間差異Peak峰
	7、差異m6A Peak富集	差異Peak峰的GO富集、KEGG富集分析
高級分析	8、多組學(xué)整合關(guān)聯(lián)分析	與基因組，轉(zhuǎn)錄組，代謝組等數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析
	9、關(guān)聯(lián)臨床信息分析	結(jié)合樣本臨床信息進行統(tǒng)計分析挖掘
	10、其它定制化分析	結(jié)合課題背景亮點挖掘

案例1 去甲基化酶ALKBH5通過PKMYT1 m6A修飾抑制胃癌的侵襲

Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer 21, 34 (2022) (IF=41.44)

研究方案：胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。胃癌轉(zhuǎn)移是癌癥治療失敗的主要原因之一，但N6 -甲基腺苷(m6A)與胃癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性報道較少。本研究采用Merip-seq檢測胃癌組織和正常組織（各三個重復(fù)）中的m6A修飾變化，qRT-PCR和IHC檢測ALKBH5在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達，聯(lián)合RNA-seq和MeRIP-qRT-PCR技術(shù)篩選ALKBH5靶基因，后使用RNA Pull Down、質(zhì)譜法和Merip-seq篩選靶基因的“reader調(diào)控蛋白”。

研究亮點：關(guān)聯(lián)m6A和基因表達，鑒定ALKBH5靶基因及靶基因的調(diào)控蛋白

研究結(jié)果：1.胃癌組織中檢測到ALKBH5表達降低，去甲基酶ALKBH5干擾促進胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。2.鑒定PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點，促進了GC的侵襲和遷移。3.由ALKBH5敲低或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達上調(diào)表明ALKBH5以m6a依賴的方式調(diào)節(jié)PKMYT1的表達。4.IGF2BP3通過其m6A修飾位點幫助穩(wěn)定PKMYT1的mRNA穩(wěn)定性

圖1 MeRIP-seq揭示m6A與細(xì)胞粘附相關(guān)，ALKBH5與胃癌預(yù)后相關(guān)

案例2 番茄果實膨脹過程中mRNA m6A甲基組的獨特特征

Unique features of mRNA m6 A methylomes during expansion of tomato (Solanum lycopersicum) fruits

研究方案：盡管m6A在胚胎發(fā)育、花期控制、小孢子產(chǎn)生、果實成熟和逆境響應(yīng)等許多生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用，但其在植物發(fā)育其他方面的作用仍有待探索。該研究通過平行的m6A免疫沉淀測序(m6A-seq)和RNA-seq分析，揭示了m6 A沉積與番茄果實膨脹之間的潛在聯(lián)系，鑒定番茄果實從未成熟綠期向成熟綠期擴展的過程中的m6A水平和基因表達之間的關(guān)系。

研究亮點：多組學(xué)聯(lián)合分析，兩種抑制劑處理，關(guān)聯(lián)表型

研究結(jié)果：1.開花后12，20,28天的番茄果實中全RNA和mRNA的m6A甲基化程度的逐步提升，分別檢測到15720、16547和16381個m6A Peak。2.大量參與生長素和赤霉素信號傳導(dǎo)基因，以及一些與細(xì)胞擴增和果皮厚度相關(guān)的基因都含有m6A修飾。3.m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑DA的注射降低m6A水平，加速果實成熟；去甲基化酶抑制劑MA的注射則延緩果實成熟。

圖二直接注射m6A轉(zhuǎn)移酶抑制劑或去甲基化酶抑制劑對番茄果實發(fā)育的影響

常見問題

1. 為什么MeRIP-seq需要測兩個樣本（Input和IP）？

常規(guī)m6A MeRIP-seq中Input和IP構(gòu)成一對組合。IP樣品使用m6A抗體特異性富集具有甲基化修飾的RNA，而Input則是僅含有RNA的對照，通過消除背景噪音和峰值PEAK計算，將兩個樣本不同m6A區(qū)域計算出來。

2. MeRIP-seq后續(xù)的實驗怎么安排？

在利用MeRIP-seq得到m6A甲基化差異基因后，下一步可以通過MeRIP-qPCR直接對該基因進行驗證。也可以通過關(guān)聯(lián)多組學(xué)（比如RNA-seq）分析基因表達和m6A修飾的變化，從多方面挖掘分析內(nèi)容。